آنزیم Klen -Taq-DNA Polymerase

آنزیم Klen-Taq DNA Polymerase یک آنزیم نوترکیب و مقاوم به حرارت بالا است که برای سنتز DNA در دمای بالا مناسب می‌باشد. این آنزیم نسخه بهبودیافته آنزیم کامل Taq-DNA Polymerase است که با حذف دومین ابتدایی، وزن مولکولی آن به ۱۸ کیلودالتون کاهش یافته و در نتیجه مقاومت حرارتی بالاتر و سرعت تکثیر بیشتری دارد. آنزیم Klen-Taq DNA Polymerase ساخت کارمانیا پارس ژن به دلیل داشتن جهش‌های انتخابی، عملکرد بهتری نسبت به آنزیم‌های مشابه در بازار دارد. این آنزیم واکنش پلیمریزاسیون نوکلئوتیدها در DNA دو رشته‌ای را در جهت ′5 به ′3 در حضور MgCl₂ و pH تقریبا ۹ انجام می‌دهد و فاقد خاصیت DNase و قابلیت ترمیم (proofreading) است که همین ویژگی باعث سرعت بالای آن در تکثیر می‌شود. آنزیم Klen-Taq DNA Polymerase در دو بسته‌بندی ۵۰۰ واحدی (۵ واحد بر میکرولیتر، حجم ۱۰۰ میکرولیتر) و ۵۰۰۰ واحدی (۵ واحد بر میکرولیتر، حجم ۱۰۰۰ میکرولیتر) قابل عرضه می‌باشد.
ویژگی‌های کلیدی آنزیم:
– نوع آنزیم: DNA پلیمراز مقاوم به حرارت (Thermostable)
– وزن مولکولی: ۱۸ کیلودالتون
– جهت فعالیت: ′5 به ′3
– فاقد فعالیت: DNase و قابلیت ترمیم (Proofreading)
– سرعت: بسیار بالا به دلیل عدم وجود فعالیت ترمیمی
– مقاومت حرارتی: بالا (تایید شده در دمای ۹۸ درجه سانتی‌گراد به مدت ۲۰ دقیقه)
– غلظت: ۵ واحد بر میکرولیتر
– بسته‌بندی: ۵۰۰ واحدی (۱۰۰ میکرولیتر) و ۵۰۰۰ واحدی (۱۰۰۰ میکرولیتر)
ترکیبات بافر ذخیره‌سازی:
– Tris-HCl (pH 8.1): ۲۰ میلی‌مولار
– EDTA: ۲.۰ میلی‌مولار
– 2-Mercaptoethanol (2ME): ۸ میلی‌مولار
– تثبیت‌کننده‌ها و گلیسیرین: ۸۸ درصد
ترکیبات بافر PCR 10X:
– Tris-HCl (pH 8.8): ۲۰۰ میلی‌مولار
– KCl: ۵۰۰ میلی‌مولار
– تریتون X-100: ۰.۵ درصد
– بافر حاوی ۱۰ میلی‌مولار MgCl₂ می‌باشد که در این غلظت بهینه شده است (مقادیر بیشتر تا ۸۰ میلی‌مولار توسط کاربر قابل اضافه شدن است)
کنترل کیفی:
– آزمون پایداری حرارتی: ۲۰ واحد آنزیم در دمای ۹۸ درجه سانتی‌گراد به مدت ۲۰ دقیقه انکوبه شد و سپس در واکنش PCR استفاده گردید و پایداری آنزیم در دمای بالا تایید شد
– عدم وجود فعالیت خوردکنندگی DNA: ۰.۵ میکرولیتر DNA pBR322 سوپرکویل با آنزیم در بافر آزمایشی به مدت ۴ ساعت در دمای ۷۲ درجه سانتی‌گراد انکوبه شد و آسیبی به DNA سوپرکویل وارد نگردید
کاربردهای آنزیم:
– بیولوژی مولکولی
– واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)
– TA-cloning
– نشانه‌گذاری DNA (DNA labeling)
– توالی‌یابی DNA (DNA sequencing)
– PCR برای کلونینگ
پروتکل پیشنهادی PCR (حجم ۲۰ میکرولیتر):
– بافر PCR ۱۰X: ۲ میکرولیتر (غلظت نهایی ۱X)
– مخلوط dNTP (۱۰ میلی‌مولار): ۱ میکرولیتر (غلظت نهایی ۰.۱۲۵ میلی‌مولار هر کدام)
– پرایمرها (۱۰ میکرومولار هر کدام): ۰.۵ میکرولیتر (غلظت نهایی ۰.۵ میکرومولار هر کدام)
– DNA الگو: ۱ میکروگرم
– آنزیم Klen-Taq DNA Polymerase: ۰.۵ میکرولیتر (۵/۲ واحد در هر واکنش ۲۰ میکرولیتری)
– آب عاری از RNase/DNase: تا رسیدن به حجم ۲۰ میکرولیتر
برنامه پیشنهادی برای ترموسایکلر:
– مرحله ۱: ۹۵ درجه سانتی‌گراد به مدت ۲ دقیقه
– مرحله ۲ (۳۵-۴۰ سیکل):
– ۹۵ درجه سانتی‌گراد به مدت ۲۰ ثانیه
– ۵۰-۶۵ درجه سانتی‌گراد به مدت ۲۰ ثانیه (دمای اتصال پرایمر)
– ۷۲ درجه سانتی‌گراد به مدت ۳۰-۶۰ ثانیه (زمان گسترش)
– مرحله ۳: ۷۲ درجه سانتی‌گراد به مدت ۵ دقیقه (گسترش نهایی)
کلمات کلیدی مرتبط:
آنزیم Klen-Taq DNA Polymerase، پلیمراز مقاوم به حرارت، Taq DNA Polymerase، PCR، تکثیر DNA، آنزیم نوترکیب، کلونینگ، TA-cloning، توالی‌یابی DNA، نشانه‌گذاری DNA، آنزیم بدون ترمیم، Klen-Taq